CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)給分子生物學(xué)領(lǐng)域帶來了一場變革。研究者們只需使用細菌核酸酶Cas9和引導(dǎo)酶切位點的短RNA，就能夠在活體生物中有效敲除或者改變基因序列。
　　
　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)原本是細菌的一種適應(yīng)性免疫，不過人們發(fā)現(xiàn)它能作用于多種生物，從致病菌、植物到靈長類動物。目前絕大多數(shù)CRISPR研究是在動物系統(tǒng)中進行的，但研究證明CRISPR/Cas9也可以在擬南芥、煙草、高粱、水稻和小麥中介導(dǎo)突變生成。這個強大的技術(shù)既可用于雙子葉植物也可用于單子葉植物。
　　
　　與如火如荼的動物研究相比，植物CRISPR研究是一個比較冷門的方向。這就像是一塊沒有被完全開發(fā)的景點，走進去往往可以領(lǐng)略到不一樣的風(fēng)景。那么，假如我們涉足這一領(lǐng)域需要注意哪些主要的問題呢？
　　
　　核酸遞送
　　
　　在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，核酸酶根據(jù)RNA的指引在自定義位點上切割DNA。細胞會通過非同源性末端接合（NHEJ）或者同源重組修復(fù)（HDR）來修復(fù)這樣的損傷。NHEJ會引入移碼突變，一般用來進行基因敲除。HDR可以根據(jù)模板DNA進行修復(fù)，一般用于校正突變或者插入報告基因。不過需要注意的是，NHEJ發(fā)生的頻率比HDR高，往往需要進行大量的篩選才能找到正確修復(fù)的克隆。
　　
　　CRISPR/Cas9在不同生物中的基因組編輯過程是大同小異的。不過植物研究面臨著一些特殊的問題，比如核酸遞送，明尼蘇達大學(xué)基因組工程中心的主管DanVoytas說。他也是Calyxt公司的科技總監(jiān)，該公司主要是為農(nóng)業(yè)應(yīng)用開發(fā)基因組工程技術(shù)。
　　
　　“你需要將DNA引入細胞或者組織，然后讓其長成完整的植株，”Voytas說。
　　
　　雖然核酸遞送在有些植物（比如土豆、煙草和油菜）中相對比較容易，但其他植物的核酸遞送是相當困難的，Voytas解釋道。因為細胞壁的存在，適用于哺乳動物細胞的DNA遞送機制（比如電穿孔和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染）難以作用于天然的植物細胞。
　　
　　植株再生
　　
　　DNA遞送成功之后，研究者們還需要鑒定正確修飾的細胞，并讓其生長成完整植株。而植株再生（相當于從胚胎獲得轉(zhuǎn)基因小鼠）是一個相當耗費時間的麻煩過程。
　　
　　“用哺乳動物細胞，我們兩三天就能做一次驗證實驗。但植物研究要困難得多，”Sigma-Aldrich公司的首席研發(fā)科學(xué)家FuqiangChen說。“植物生長周期長，轉(zhuǎn)化效率低，而且實驗方案也并不容易。”
　　
　　Voytas和同事最近用TALEN技術(shù)改良了土豆對冷藏的耐受性。他們首先生成原生質(zhì)體，然后向其中引入編碼TALEN蛋白的質(zhì)粒，并使其長成完整植株。他們經(jīng)過12周到幾個月的時間才得到可以收獲嫩枝的植株，這些植株隨后需要轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中以便繼續(xù)生長。
　　
　　大規(guī)模篩選
　　
　　因為人們對轉(zhuǎn)基因作物的擔(dān)憂，植物研究者很少使用選擇性標記，這也是個大問題。植物CRISPR研究大多采用瞬時表達，在數(shù)百個生物體中篩選成功的轉(zhuǎn)化株。舉例來說，Voytas等人在土豆研究中篩選了六百個嫩枝，找出五個符合要求的轉(zhuǎn)化株。
　　
　　當然，基因組編輯技術(shù)在植物研究中也有顯著的優(yōu)勢，比如說可以靶標多個等位基因。哺乳動物是雙倍體，需要敲除兩個拷貝的基因。植物大多是多倍體，一個基因有多個拷貝，而基因組編輯工具可以很容易地將其全部敲除。Voytas靶標的土豆基因有四個拷貝。另外，還有研究者用CRISPR/Cas9和TALEN制造抗白粉病的小麥，成功敲除了六個等位基因。
　　
　　可以選擇的工具
　　
　　假如你對植物CRISPR研究感興趣，市面上可供選擇的工具其實并不少。Addgen、安捷倫、Clontech、GEDharmacon、HorizonDiscovery、Origene、Sigma-Aldrich、賽默飛世爾等公司都有這樣的試劑。
　　
　　舉例來說，Sigma-Aldrich公司提供有一系列CRISPR/Cas9質(zhì)粒、純RNA、慢病毒顆粒和CRISPR文庫、載體和遞送系統(tǒng)。安捷倫公司推出了純化的Cas9蛋白以及引導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒（大多用于體外實驗）。GEDharmacon的CRISPRRNAconfigurator程序可以直觀的設(shè)計crRNA，研究者們只需要簡單輸入目的基因。
　　
　　了解SigmaCRISPR產(chǎn)品的詳細信息
　　
　　此外，你還可以從非贏利的Addgene獲得大量的CRISPR工具。2014年六月PLOSBiology上的一篇文章顯示，Addgene收藏有“44個不同實驗室的400個質(zhì)粒”。據(jù)Addgene的JoanneKamens介紹，在那之后Addgene的CRISPR目錄已經(jīng)增長到了50個實驗室的上千種試劑，包括已驗證的引導(dǎo)RNA，用于引導(dǎo)RNA克隆的空載體，和Cas9表達質(zhì)粒。值得注意的是，Addgene的收藏中包括有8個實驗室的32種植物特異性質(zhì)粒。
　　
　　美國用戶只需要$65（單價）就可以獲得Addgene的試劑，因此CRISPR/Cas9實驗的門檻其實是很低的。不過核酸遞送仍舊是個大問題，Voytas指出。他建議研究者們多花時間在培養(yǎng)基和實驗方案的開發(fā)和優(yōu)化上。

(來源：生物通)