在一項新研究中，麻省理工學院的研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對受到感染的哺乳動物肝細胞進行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒（HBV）DNA。根據(jù)發(fā)表在《Scientific Reports》雜志上的研究結(jié)果，該研究小組靶向切割了HBV病毒共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的一些特異位點。

      根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報道，全球有20多億人曾受到過乙型肝炎病毒感染，大約3.5億至4億人罹患慢性HBV感染，在亞洲和非洲發(fā)病率尤其高。他們面臨著形成肝硬化或甚至肝癌的高風險。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物可以控制乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝臟中的HBV會重新活化。這是因為cccDNA “匿藏”在細胞核中。

      HBV的基因組（rcDNA）進入到細胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主細胞因子的幫助下修復成cccDNA。前基因組RNA（pgRNA）出核后，在胞質(zhì)中形成εpgRNA，并與病毒的聚合酶P蛋白共價結(jié)合，誘發(fā)核衣殼化。與多數(shù)其他的病毒DNA的機制不同，HBV cccDNA通過pgRNA的反轉(zhuǎn)錄進行復制，而cccDNA主要以微小染色體的形式存在于肝細胞內(nèi)，且其半衰期很長（33～100天），細胞核內(nèi)的最長壽命可達14年。

      只要還存在于肝細胞中，cccDNA乙肝病毒的復制就不會停止，并與病毒蛋白裝配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝細胞，而這是導致乙肝復發(fā)的根本原因。因此，盡管每個肝細胞內(nèi)只有約5～50個cccDNA拷貝，但是只要這些cccDNA池穩(wěn)定，就可以使得病毒的持續(xù)感染延續(xù)，因而清除肝細胞內(nèi)的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。

      CRISPR （clustered regularly interspersed short palindromic repeats）/Cas是源于細菌及古細菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，它可利用靶位點特異性的RNA指導Cas蛋白對靶位點序列進行修飾。其中的一個關(guān)鍵因子就是Cas酶，能用于切斷靶標DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一個就是稱為導向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過互補結(jié)合靶標。隨著以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)靶標特異性不斷得到提高，其在血液病、腫瘤、傳染病和其他遺傳疾病等一系列與人類健康和疾病相關(guān)的基因治療的應用領(lǐng)域展現(xiàn)出極大的應用前景。

      論文的主要作者之一Vyas Ramanan說：“我們?yōu)槲磥砝肅RISPR/Cas9來靶向慢性HBV感染提供了強有力的理論依據(jù)。”

      Ramanan和同事們設(shè)計了24條單鏈向?qū)NAs （sgRNAs）來靶向從在線病毒序列信息資源庫中鑒別出的一些HBV基因組位點。經(jīng)過初篩測試后，研究小組將三個最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉(zhuǎn)導到了整合HBV的人類肝細胞內(nèi)。

      Ramanan說：“對包含整合基因組病毒DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系展開實驗，我們看到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時cccDNA下降了92%。”研究小組還觀察到病毒基因表達和復制均顯著減少。“進一步地在從頭感染模型中我們開展研究，在第9天我們看到這些病毒參數(shù)同樣大幅度降低。”

      現(xiàn)在，Ramanan計劃在人類肝嵌合小鼠模型中測試這一方法，以評估和優(yōu)化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達人類功能性的治愈。

      “盡管還有很多的工作要做，但我認為這是一個有趣的開始，”Ramanan說。

(來源：生物通)